martes, 30 de octubre de 2012


2.2.5 Esterilización con calor húmedo

El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas celulares. El principal método de esterilización que emplea calor húmedo es la esterilización por vapor a presión. Existen otros métodos de descontaminación que emplean este tipo de calor los cuales, aunque no permiten la destrucción total de los microorganismos, disminuyen la carga microbiana que posee un material.

 

Entre estos métodos podemos citar:

Tindalización (esterilización fraccionada)

Agua hirviendo

Pasteurización

Olla de presión

 

Ebullición:

Es un método simple, pero no es el ideal ya que no produce esterilidad pues no reduce las formas de resistencia o esporos, ni a los virus; por lo tanto su empleo se limita a casos de emergencia. En realidad mediante este método solamente disminuye la contaminación.

Pueden "esterilizarse" por ebullición material de vidrio jeringas, tubos, etc.)

 

Excepcionalmente instrumental metálico, teniendo en cuenta que este puede experimentar procesos de oxidación y el consiguiente deterioro de los elementos cortantes (tijeras, bisturí).

La corrosión del material oxidante puede disminuir con el agregado de sustancias alcalinizadas (carbonato de sodio, cloruro de potasio, nitrato de potasio o de sodio, carbonato de potasio, etc.) en el agua; además tienen la propiedad de elevar el punto de ebullición siendo por este motivo, más efectiva la eliminación de las formas de resistencia. El tiempo mínimo de ebullición debe ser de 15 minutos, destruyéndose las formas vegetativas entre 3 y 5 minutos.

 

Vapor de agua saturada y a presión:

Este procedimiento se realiza mediante el empleo del autoclave, pudiendo utilizarse también el método de la olla de presión.

Partes del autoclave:

 

1. Dos cilindros metálicos, uno mayor (camisa externa), que contiene en su interior a otro (camisa interna), en la base posee una lámina cribada que permite observar el nivel del agua (y colocarla) y el pasaje de vapor.

2. Tapa de bronce que se adapta perfectamente al aparato y se cierra herméticamente mediante mariposas con arandelas.

3. Válvulas de seguridad con pesas.

4. Manómetro que mide la presión del sistema, con lo que también se mide la temperatura

5. Espita de descarga o robinete.

6. Fuente de calor.

 

Manejo del autoclave:

 

a) Colocar agua hasta unos centímetros (2 ó 3) por debajo de la lámina cribada.

b) Acondicionar el material a esterilizar en el interior del autoclave; puede colocarse en tambores o paquetes; es aconsejable dejar un espacio suficiente (unos pocos centímetros) entre los paquetes, y entre estos y las paredes del autoclave para permitir la circulación del vapor. Recordar que los tambores deben colocarse con las cribas abiertas.

c) Cerrar la tapa e ir ajustando las mariposas de a pares opuestos.

d) Abrir la espita.

e) Encender la fuente calórica.

f) Comenzará a salir por la espita vapor discontinuo (chorros de vapor y aire intercalados); esto significa que el autoclave se está purgando (está saliendo el aire que hay en su interior). Cuando la salida de vapor se hace continua se procede al cierre del robinete (el autoclave ya se ha purgado).

g) Observar la presión (manómetro) hasta que alcance el nivel deseado.

h) Regular la fuente calórica una vez alcanzado dicho nivel para mantener la presión y la temperatura constantes y evitar que siga ascendiendo. A partir de ese momento se comienza e contar el tiempo.

i) Una vez transcurrido el tiempo necesario para la esterilización se apaga la fuente calórica.

j) Descomprimir rápidamente mediante la apertura total de la espita para favorecer fa eliminación de vapor y e1 secado del material esterilizado. Cuando se colocan a esterilizar líquidos (cultivos en microbiología, por ejemplo), la descompresión debe ser lenta para evitar su ebullición.

k) Destapar el autoclave y dejar enfriar.

Temperaturas de esterilización: 121°C...........1 atmósfera

134°C...........2 atmósferas

 

El tiempo de esterilización varía de acuerdo al material a esterilizar y a la temperatura utilizada. Ej.: para el instrumental metálico es de 20 minutos cuando se utilizan 121°C - 1 atmósfera y de 15 minutos a 134°C - 2 atmósferas.

Para la lencería quirúrgica el tiempo aumenta un 50%.

BIBLIOGRAFIA

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.

 

2.2.4 Factores que intervienen en el proceso de esterilización

La eficacia de un proceso de esterilización depende de cómo se realice el proceso en sí y de múltiples factores relacionados con el objeto: estructura física, nivel de contaminación inicial, de limpieza, compatibilidad con el proceso de esterilización, tipo de envoltorio, etc.

Todas las fases de un proceso de esterilización (limpieza, preparación del equipo, esterilización, almacenaje y transporte) deben validarse y controlarse.

 

 

El proceso de esterilización supone un reto importante para el material con luces o conductos largos o con espacios muertos. Para estos instrumentos será necesaria la aplicación de prácticas específicas.

 

Nivel de contaminación del objeto: presencia de materia orgánica y de microorganismos

 

Pueden alterar y condicionar el proceso de esterilización y derivar al fracaso del mismo. La presencia de proteínas protege a los microorganismos frente a la acción de los agentes esterilizantes, específicamente los químicos. Con el fin de eliminar la materia orgánica y reducir la carga microbiana (y garantizar con ello la eficacia del proceso de esterilización), el material debe descontaminarse previamente mediante una limpieza exhaustiva. Algunos autores demuestran que después de una limpieza minuciosa de material de difícil acceso contaminado artificialmente (fibroscopios, agujas espinales, catéteres) se logra una reducción microbiana de entre un 99.90% y un 99.99%.

 

Configuración física del material:

Los avances científicos en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades han desarrollado una gran diversidad de material crítico con distinta forma, tamaño, complejidad, fragilidad y sensibilidad. En función de su estructura y configuración física se elegirá un determinado procedimiento de esterilización.

 

En el Real Decreto 414/1996 del 1 de Marzo, transposición de la Directiva 1993/42/CEE, se regulan y clasifican los productos sanitarios; en él se especifica la responsabilidad del fabricante de describir las condiciones requeridas para reprocesar el material, sin modificar su funcionalidad y características. El profesional sanitario tiene la responsabilidad de aplicar el proceso de esterilización más adecuado y demostrar que puede reproducirlo exactamente.

 

Limpieza del material previa a la esterilización:

El proceso de limpieza se define como la aplicación de un procedimiento físico-químico encaminado a eliminar la suciedad y otros materiales ajenos al objeto. La limpieza previa de un objeto es una práctica indispensable para garantizar la efectividad de un proceso de desinfección o esterilización. El agua y los detergentes usados en la limpieza deben reunir unas características determinadas. Agua es importante verificar la calidad del agua para conseguir la máxima eficacia del detergente. Un agua dura puede disminuir su efectividad. Para evitar la corrosión del instrumental quirúrgico se recomienda la utilización de agua desmineralizada durante el proceso de limpieza o, como mínimo, en el último aclarado. Nunca debe utilizarse suero fisiológico para limpiar y/o aclarar el instrumental porque puede producir corrosión. Es también importante controlar la temperatura del agua, que no ha de ser excesivamente elevada (entre 20ºC y 45ºC); temperaturas altas favorecen la coagulación de la albúmina y dificultan su eliminación.

El detergente Los detergentes neutros (pH 7) están indicados para la limpieza de instrumental quirúrgico delicado, pero son menos eficaces para la eliminación de sustancias orgánicas. Algunos sistemas automatizados de lavado de instrumental utilizan detergentes ligeramente alcalinos (pH de 8 a 11) que se neutralizan posteriormente en el aclarado. Se ha demostrado que los detergentes enzimáticos son más efectivos que los detergentes alcalinos para la limpieza del material de difícil acceso. Su eficacia está relacionada con el hecho de contener endopeptidasas, enzimas que hidrolizan los enlaces de la molécula proteica y facilitan así la eliminación de contaminantes de base proteica como sangre y secreciones. Cuando se utilice un detergente en polvo hay que tener la precaución de disolverlo previamente, ya que podría obstruir canales o iniciar un proceso de corrosión si alguna partícula quedase incrustada en alguna ranura del instrumental. Deben evitarse los detergentes espumantes porque dificultan el contacto del detergente con el objeto. Los detergentes deben diluirse correctamente según las indicaciones de cada fabricante. En la limpieza previa a la esterilización no est indicado el uso de detergentes desinfectantes, pues se inactivan fácilmente en presencia de materia orgánica y reducen poco la carga microbiana, proporcionando una falsa seguridad a las personas que los utilizan.

 

2.2.3 Tipos de esterilización

Métodos de esterilización:

 

a)    Calor:

·         calor seco

·         calor húmedo

 

b)   Agentes químicos:

·         gases (óxido de etileno),

·         glutaraldehído,

·         formaldehído

 

     c) Filtración:

·         Filtros de membrana 

·         Cámara de flujo laminar

 

d) Radiación: radiación ionizante y no ionizante

Calor seco

Mecanismo de acción Procesos de Oxidación y desnaturalización de proteínas Control del proceso Indicador biológico esporas de Bacillus subtilis Aire caliente Se consigue esterilización a

170ºC, 60 minutos o 160ºC a120 minutos

 

Usos:

_ Esterilización de materiales resistentes al calor, sustancias no miscibles en agua (inyectables oleosos, siliconas, vaselina líquida), polvos

 

_ Incineración: Flameado (>500 ºC)

Calor húmedo

Procesos:

_ Vapor saturado a presión mayor que la atmosférica

(Autoclave)

_ Tindalización

_ Mecanismos de acción:

_ Desnaturalización de proteínas

_ Destrucción de ácidos nucleicos

 

Filtros de membrana

Se emplea para materiales sensibles al calor: medios de cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos, etc.

 
Cámara de flujo laminar
Protege la muestra, el operador y el medio ambiente
_ Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air)
 
BIBLIOGRAFIA
Curso de Microbiología 2010 – Facultad de
Agronomía.pdf
 

 

2.2.3 Definición

Es el conjunto de procedimientos que destruyen los gérmenes, impiden su desarrollo y evitan la contaminación; este término se aplica en general a los objetos fácilmente manipulables.

No existen grados de esterilización; un elemento está estéril o no lo está, es decir que los términos bien y mal esterilizados son ilógicos, pues si pensamos que algo está bien esterilizado basta con que digamos que está estéril, y si pensamos que está mal esterilizado es porque contiene alguna forma de vida microbiana convirtiéndose en fuente de infección, por lo tanto no está estéril.

Es imprescindible que durante la esterilización se deterioren lo menos posible los materiales que sometemos a dicho proceso.

 

BIBLIOGRAFIA



2.2 Esterilización

2.2.2 Generalidades

La esterilización es un proceso físico o químico que destruye todo microorganismo tanto en su forma vegetativa como sus esporas en el medio u objeto a esterilizar. La esterilización es un término absoluto, ya que no existe medianamente estéril o casi estéril. Métodos de Esterilización:

 

      Químicos : Líquidos : Glutaraldehido 2%

      Gases : Oxido de Etileno

      Calor : Seco : Pupinel

      Húmedo : Vapor de agua saturado a presión

      Físicos : Radiaciones

 
  • Esterilización: eliminación o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia, y que se encuentran acondicionados de tal forma que no pueden contaminarse nuevamente.
  • Sanitizante: agente que disminuye la carga microbiana total a un nivel el cual es seguro para la salud de la población. Sólo es aplicable sobre objetos inanimados.
  • Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como habitaciones.
  • Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas (sólo pueden aplicarse externamente sobre seres vivos).
  • BIBLIOGRAFIA

 

2.1.6. Preparación de los medios de cultivo.

La preparación de los medios de cultivo deshidratados, es en esencia, una simple manipulación que pone especial atención en la calidad del medio y en la esterilidad del proceso. Si se utiliza un medio comercializado, las instrucciones de uso vienen detalladas en cada envase y debe seguirse de forma estricta. La preparación de los medios de cultivo, consta de tres partes, medios deshidratados (seguir instrucciones del fabricante), material (agua y esterilización). Respecto al agua, esta debe de ser destilada y no debe de contener cloro, además debe de presentar una conductividad adecuada y un contenido iónico.

En la preparación de los medios de cultivo en un laboratorio de Microbiología, se siguen los siguientes pasos:

Preparación del Medio de Cultivo

1. Preparar las cantidades correctas de compuestos del medio de cultivo por separado.

2. Poner el agua destilada a calentar en una olla de vidrio, esmaltada o revestida de teflón.

3. Encienda el horno a 150 ºC.

4. Cuando está a punto de hervir el agua se apaga el fuego y se virten en la olla los componentes

5. Mezclar usando una cuchara de madera o de plástico hasta disolver todos los componentes

6. Mida el pH y ajústelo (use HCL para disminuirlo y NaOH para incrementarlo).

7. Distribuya el medio de cultivo en los tubos de ensayo y frascos. Tenga cuidado que el medio de cultivo no entre en contacto con la apertura de los frascos, ya que esto puede ayudar a la contaminación por hongos y bacterias. El embudo de vidrio es sumamente útil.

8. Cada frasco debe recibir en el fondo una cantidad de preparado de más o menos 1 centímetro (50 ml) lo que nos permite hacer con cada litro de preparado más o menos 20 frascos.
 
 
Terminado el fraccionamiento, tapamos bien los frascos. En los tubos de ensayo se debe poner un tapón de algodón y pasamos a la otra etapa que será la esterilización de los frascos y del medio de cultivo.
10. Ahora se debe cubrir los frascos con papel aluminio. En los tubos de ensayo se recomienda cubrirlos con doble papel aluminio para asegurar que los tapones de algodón permanezcan en su lugar. Por último ponga todos los frascos en el Horno previamente encendido.

 
 
11. Después de 30 minutos apague el horno pero no lo abra aún. Permita que los frascos se enfríen en el horno cerrado. Se recomienda preparar el medio de cultivo después de la comida de la noche, así los frascos pueden permanecer en el horno hasta la mañana siguiente.
12. Saque los frascos del horno y déjelos descansar al menos por 5 días para asegurarse que estén estériles.
BIBLIOGRAFIA
 
2.1.5. Preparación y manejo de soluciones stock.
 
 

2.1.4.4. Complejos orgánicos.


Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas concentraciones que no pueden ser sintetizados por la célula que los necesita. Por esta razón, deben ser agregados al medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B, algunos aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos. Hay ejemplos clásicos como los factores X y V (porfirinas) de la sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para crecer. El suero fetal bovino, que aporta numerosos factores de crecimiento, es imprescindible para el cultivo de células animales.Cómo surge la necesidad de un factor de crecimiento. La capacidad de sintetizar un compuesto esencial está relacionada con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genéticas, alguna enzima de la secuencia no puede ser sintetizada, la serie de reacciones se bloquea en algún paso y no finaliza con éxito. El compuesto que por esta razón dejó de sintetizarse, se convierte en un factor de crecimiento.

2.1.4.3. Materiales inertes y gelificantes.
Su agregado al medio de cultivo es opcional.

El más usado:

El agar, es un polisacárido ácido derivado de algas marinas, formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato cada 10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en pequeñas concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de composición química estrictamente definida destinados a autótrofos. Se usa sin problemas en medios de cultivo complejos para quimioorganotrofos.

Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia sólida normal, al 0.2-0.3% en medios semisólidos o blandos, al 5% en medios de consistencia muy firme para detener el crecimiento de gérmenes muy móviles, y al 0% cuando se preparan medios líquidos (caldos).

Sus características:
Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C.
A 45-55°C se pueden agregar suspensiones de células sin afectar la viabilidad (supervivencia) de las mismas.
Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la mayoría de las bacterias patógenas del hombre.
No es tóxico para las bacterias, ni es degradado por éstas.
Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias (poblaciones de microorganismos derivadas de una única célula), lo que resulta imposible en medios líquidos!
Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.
Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para permitir la difusión de los nutrientes del medio de cultivo en todas direcciones, y suficientemente cerrada –según la concentración empleada- para impedir la movilidad de los microorganismos.


Otros solidificantes:
Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa intensamente para fines específicos en Inmunología y Biología Molecular.
Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de cultivo para autótrofos, cuando debe excluirse materia orgánica del medio de cultivo.
Gelatina: es una proteína obtenida por hidrólisis del colágeno. Fue el primer solidificante usado en Microbiología, pero es degradado por la mayoría de las bacterias (lo comen, por lo que el medio inicialmente sólido termina convertido en medio líquido) y la temperatura de incubación no puede ser mayor a 22°C (es el punto de fusión) con lo que cultivos sólidos a temperaturas más altas resultan inviables.
Albúmina de huevo, suero: a 80°C estas proteínas coagulan y solidifican el medio de cultivo.

viernes, 26 de octubre de 2012


2.1.4.2. Compuestos  orgánicos.

Se pueden utilizar sustancias puras o mezclas de sustancias orgánicas Como sustancias puras más comunes se encuentran los azúcares: Frecuentemente son utilizados como fuente de carbono y energía por los microorganismos. Entre ellos, es común el empleo de monosacáridos como la glucosa, disacáridos como la lactosa y polisacáridos como el almidón. Ciertas bacterias no pueden utilizar los carbohidratos como nutrientes y se emplean otras sustancias puras (aminoácidos, ácidos grasos) o mezclas de sustancias orgánicas.

Cuando los requerimientos nutricionales de los microorganismos son complejos o se pretende un crecimiento rápido se utilizan mezclas de sustancias orgánicas. Las mezclas de sustancias orgánicas más comunes en la preparación de los medios de cultivo son las peptonas, el extracto de carne y el extracto de levadura

BIBLIOGRAFIA



 

2.1.4. Componentes del medio de cultivo.

Los componentes de un medio de cultivo dependen del microorganismo que se pretende cultivar y de la finalidad del cultivo. A continuación se describe que es general la necesidad de utilizar: agua, sustancias orgánicas y sustancias inorgánicas. Los medios de cultivo sólidos llevan además un agente solidificante.


2.1.4.1. Compuestos inorgánicos.

Quizá los requerimientos minerales mas obvios son los de fósforo (necesario para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos), de azufre (aminoácidos cisteína y metionina) o nitrógeno (el segundo elemento tras el carbono entre los que forman la célula). Aunque se pueden utilizar fuentes orgánicas, es común usar como fuente de fósforo un fosfato, la de azufre como un sulfato y la de nitrógeno como nitrato o una sal de amonio.

Sus funciones en un medio de cultivo pueden ser poco específicas, (como el NaCl para ajustar la osmolaridad del medio) o pueden ser requeridas específicamente en el metabolismo (como las sales de K+, Mg2+, Ca2+, Fe3+, etc.).
BIBLIOGRAFIA



2.1.3.2.  Tipos de medio de cultivo.

Atendiendo a su estado físico:
·         Líquidos
·         Semisólidos
·         Sólidos

Atendiendo a su utilidad práctica:
Medios para aislamientos primarios:
Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.)
Ø  Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancias añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina).
Ø  Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).
Ø  Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

Medios para identificación:
Ø  Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación).

BIBLIOGRAFIA