2.1.2.2. Equipo de laboratorio.

Suponiendo que se establece un laboratorio de cultivo de tejidos de tamaño medio; se requiere, para ponerlo en funcionamiento, las siguientes piezas de equipo estándar:

      I.        En el área de preparación:

·         refrigerador

·         balanzas (una macrobalanza y de una precisión)

·         potenciómetro

·         plancha eléctrica con agitador magnético

·         frasco Erlenmeyer (125,250 y 500ml)

·         botellas y material de vidrio o plástico.

 

    II.        En el área de lavado y esterilización:

·         Autoclave manual o automático(grande o de mesa)

·         Destilador de vidrio

·         Gradilla para secado

·         Bandejas de aluminio y de plástico de varios tamaños

·         Recipientes  de plástico grandes

·         Estufa para esterilización y secado.

 

   III.        En área de transferencia:

·         Gabinete de flujo laminar

·         Microscopio de disección con luz incidente

·         Instrumentos de disección: cuchillas, mango para cuchillas, agujas de disección, pinzas, tijeras, navajas de afeitar.

·         También se necesitan frascos con alcohol

·         Mascaras

·         Guantes

·         Marcadores prueba de agua

·         Bandejas

  IV.        En el área de incubación:

·         Un cuarto con temperatura

·         Iluminación

·         Humedad relativa controladas

·         Bandejas

·         Termómetros de máxima y mínima

·         Gradilla para tubos de varios tamaños

 

   V.        Área de crecimiento:

·         Macetas

·         Suelo

·         Bandejas

·         Cámaras de alta humedad.

BIBLIOGRAFIA

ü Henry, R.J.y Smith, E.C. 1946. Use of sulfuric acid-dichromate mixture in cleaning glassware. Science 104:426-427.

ü Richards, O.W. 1936. Killing organisms with chromium as from incompletely washed bichromate-sulfuric acid-cleaned

2.1.2. Material y equipo de laboratorio

2.1.2.1. Material de laboratorio.

Se utiliza bastante material de vidrio en la preparación de medio de cultivo y en la siembra de tejidos vegetales. El material que se seleccione deberá ser de alta calidad, resistente a altas temperaturas y a ácidos y no liberar sustancia alguna, especialmente aquélla que es utilizada en la conservación de soluciones madres. El vidrio corriente no sirve para la fabricación de instrumentos de laboratorio por ser muy frágil y vulnerable a los agentes químicos y físicos. Por tal razón se construyen de cristal de vidrio, pudiendo ser este de vidrio grueso o delgado.

·         Tubos de ensayo: son cilindros de vidrio de cerrado por uno de sus extremos para calentar, disolver o hacer reacciones pequeñas cantidades de sustancias.

• Matraz erlenmeyer: se utiliza para calentar líquidos, con poca pérdida de evaporación, hacer titulaciones y recristalizar un sólido.

      ·         Cajas de petri: las cajas petri no solo se utilizan para cultivos en medio sólidos, también para germinar semillas esterilizadas o bien para esterilizar tapones de hule.

·         Botellas para cultivo: para el propósito de cultivar plantas en condiciones in vitro, se utilizan botellas cilíndricas o cuadradas.

·         Botellas para reactivos y soluciones madre: se requiere muchas botellas de polipropileno de 50 ml, 100ml, 500ml para guardar soluciones madre o para hacer soluciones.

·         Jeringas dispensoras: cuando son volúmenes pequeños de medio de cultivo es muy efectiva la pipeta automática del tipo Cornwall.

 

·         Matraz aforado: Se emplea para medir con exactitud una cantidad de volumen líquido.

 

·         Goteros: permite contener sustancias. Posee un gotero y por esa  razón permite dosificar las sustancias en pequeñas cantidades.

 

 

 

·         Vasija de vidrio: para la distribución de un volumen de medio de cultivo se puede usar diferente forma.

 

·         Probetas graduadas: este material permite medir volúmenes; las hay de vidrio, de plástico y de diferentes capacidades.

BIBLIOGRAFIA

·         ROCA,  M.W.  1991, CULTIVO DE TEJIDOS EN LA AGRICULTURA FUNDAMENTOS Y APLICACIONES, EDIT. XYZ, CALI COLOMBIA. PAGINAS. 7- 10.

·         http://es.scribd.com/doc/3246492/Material-de-laboratorio

 

 

2.1.1.4. Área de incubación.

Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o cámaras de crecimiento; estas pueden ser más eficientes en cuanto al control ambiental, pero son más costosas.
El área de incubación o crecimiento in vitro debe proporcionar un buen control de la temperatura (20-28 oC), de la iluminación (variables según las necesidades: 1000 a 5000 lux) y de la humedad relativa (70-80%).
En el cuarto de incubación se instalan estanterías metálica o de madera para colocar los cultivos. Estas estanterías puede tener dimensiones variables: el ancho entre 0.30m y 1.00 m, el largo de acuerdo con el tamaño del cuarto, y la altura total de 1.80 a 2.20 m; la distancia entre entrápanos es de 0.20 a .50 m. Esta área debe incluir, además uno espacio para cultivos en agitación y para cultivos estático en oscuridad.
Es necesario propiciar una buena distribución del aire en este cuarto para evitar zonas de recalentamiento por efecto de las luces. Cuando se utilizan tubos fluorescentes, es conveniente sacar los balastros fuera de este cuarto.
Las regulación de la temperatura se puede lograr por medios de aparato de aire acondicionado de pared o de sistema central. En cualquier caso, es necesario tomas precauciones para evitar el calentamiento excesivo, instalando alarmas y controles para cortar la iluminación cuando falle el aire acondicionado.

BIBLIOGRAFIA

 

ü  http://perso.wanadoo.es/sergioram1/Micro%20incubacion.htm

 

2.1.1.3. Área de siembra aséptica.

Asepsia: técnica empleada para impedir el acceso al campo de trabajo.

Área aséptica: área limpia, diseñada y construida minimizar la contaminación por partículas viables y no viables y mantenerlas dentro de límites preestablecidos.

 

ü https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:2q5OC8k7u5QJ:jaibana.udea.edu.co/grupos/microbiol/control1.ppt+siembra+as%C3%A9ptica+diapositivas&hl=es&gl=mx&pid=bl&srcid=ADGEESgDyzpZ2Y3FAJvUVFAun_tQxCxevgFWKpTtqyOYaRJyweroaBhj0Cz-yQ-pok1gVTS1cmdRSx0Ym3oaubdIme7kXFxMM05l11dCWnas4yjrqPl5VzxZGf4OadR8_fvJR3csrNC2&sig=AHIEtbTglVlOzY3iq4o8nABEsKMrd4ntyA

ü https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:nSPfqw4TAOkJ:www.redalyc.org/redalyc/pdf/2231/223120684002.pdf+&hl=es419&gl=mx&pid=bl&srcid=ADGEESj1OFNEsYU8sDJ8pxY207sJfhtAQqx3FzGR8WSPhrmUfjurpxoqK9KaQu3okT7OsQ2x9YzcKdIy-hm7z_QCDk_89v9kOJ9ARQuyVcM7Qw3XTKUvZBPloHDsFqqb0REQbC--y2nf&sig=AHIEtbQVYaNTo4gYZ6MTYwtwrRyd3VddyQ

2.1.1.2. Área de almacenamiento.

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.  Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la precaución de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorción de agua produce cambios de pH, formación de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios químicos o estar contaminados. 

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15ºC. Sin embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos, (nunca por debajo de 0ºC porque se destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación y cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft). 

Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se determinan sus propiedades fisicoquímicas (apariencia, pH, etc.) y microbiológicas (esterilidad y promoción de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.

BIBLIOGRAFIA

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf

2.1.1.1. Área de preparación de medios de  cultivo y esterilización.

Es utilizada principalmente para preparar los medios de cultivo, debe de contar con un espacio destinado para el almacén de materiales de vidrio, plástico y reactivos químicos. El material que se encuentra en este espacio incluye mesas de trabajo o experimentación, vitrinas, estanterías, espacio para la el equipo de refrigeración, incubadora y cámara de crecimiento.

Área de esterilización

El área de esterilización, puede estar constituida por dos áreas conectadas entre si, o por un solo ambiente, y puede estar localizada dentro del área general de preparación.

Esterilización significa la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los organismos por calor, productos químicos u otra vía. Esta definición excluye por lo tanto cualquier técnica que resulte solamente en un daño a los microorganismos o atenuación de la actividad de cualquier tipo.

 

BIBLIOGRAFIA

 

ü  http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo1.pdf

ü  http://www.biologia.edu.ar/microind/esterilizaci%C3%B3n.htm

2.1.1. Áreas del laboratorio de cultivo de tejidos.

Un laboratorio de cultivo de tejidos se puede dividir esquemáticamente en áreas separadas para las diferentes funciones que se desarrollan en el, (figura 1.1); alguna de las funciones puede desarrollarse en un mismo ambiente. Las áreas o secciones principales son:

1.    Área de preparación: se utiliza principalmente para preparar los medios, pero debe proveer también un espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plástico, y los reactivos químicos. Este ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el medidor del  pH, los platos calientes con agitación, y otros elementos.

2.    Área de lavado y de esterilización: puede estar constituida por dos áreas conectadas entre si, o por un solo ambiente, y puede estar localizado dentro del área general de preparación.

      El área de lavado debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua fría una fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada; para el efecto se debe usar un destilador de vidrio o de material no toxico y un desionizador de agua colocando entre  el destilador y  el lavadero.

      Esta área debe disponer de un espacio para almacenar agua destilada en botellas de plástico; también debe proveer basureros adecuados para el material inorgánico y de vidrio que se deseche.

3.    Área de transferencia: en esta área del laboratorio se realiza el trabajo de escisión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo demanda los más altos niveles de limpieza ambiental. Se recomienda la instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado bajo presión, o la construcción de cuartos de transferencia. Sin embargo. Ciertas operaciones de inoculación, como la escisión y el cultivo de ápices y meristemas en tubo de ensayo de boca angosta, se pueden realizar sobre una mesa limpia, ubicada en el lugar  del laboratorio libre de corrientes de aire y polvo.

Los gabinetes de flujo laminar debe ubicarse, en los posibles, en un lugar alejado de la  puertas y con un mínimo de corriente de aire, con el fin de proteger la vida de los filtros.

4.    Área de incubación: Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado  o en gabinetes o cámaras decrecimiento estas pueden ser  eficientes  en cuanto al control ambienta, pero son muy costosas.

5.    Área de observación y examen: Generalmente los microscopios (estéreo, compuesto, invertido y otros) se localizan tanto en el área de incubación como en el de trasferencia, pero opcionalmente pueden estar en un área separada. El objetivo de está área es realizar observaciones periódicas de los cultivos, tanto en medios semisólido como en líquidos.

6.    Área de crecimiento: Las plantas que se regeneran en el área de incubación se pueden acondicionar o aclimatar y luego trasplantar en macetas, bandejas o camas apropiadas. Estas operaciones se pueden llevar a cabo en tinglados, casas de malla o invernaderos, dependiéndoos de las condiciones climáticas del lugar donde está ubicado el laboratorios e los requerimientos de los aislamientos de los materiales por razones fitosanitarias.
Después del trasplante, las plantas generalmente necesita un acondicionamiento gradual a las condiciones de campo, lo cual se puede lograr usando nebulización, cámaras húmedas de plástico, etc.

7.    Áreas de cuarentena y de control fitosanitario: Cuando la función del laboratorio es la producción de materiales elites de sanidad certificada, se hace necesario contar con un área para la recepción de las muestras o plantas destinadas a la limpieza clonal, generalmente protegida contra insectos. Esta área de cuarentena debe estar separadas del resto del laboratorio pero cercana al área de control fitosanitario.En el área de control sanitario se realizan las pruebas necesarias para comprobar la sanidad del material vegetal, especialmente de enfermedades causada por virus, bacterias y hongos. La mayor o menor complejidad del equipo usado para realizar estas pruebas depende del conocimiento de la patología de la especie y del grado de garantía fitosanitaria que se demanda o se desea ofrecer con el material vegetal.

8.    Área de oficina: en este se bebe ubicar  el mobiliario de oficina como escritorio, archivos y almacenamiento de datos, los libros de referencia y de control del laboratorio, los catálogos y otros documentos. También se coloca en ella el equipo de cálculo o computación.

     La seguridad física del personal del laboratorio es importante; por esta razón              debe tomar precaución para ubicar estratégicamente en el laboratorio equipos de primeros auxilios, extintores de incendios y frazadas contra fuego, así como duchas para baños del cuerpo entero y de los ojos.

BIBLIOGRAFIA

ü  http://teca.fao.org/es/read/4290

ü  Biondi, S. y Thorpe, T. A. 1981. Requirements for a tissue cultura facility, en: Thorpe, T. A. (ed). Plant tissue cultura: Methods and aplications in agricultura. Academic aparess, Nueva York. P.1-20