4.2.5.1   Plantas transgénicas

4.2.5.2   Animales transgénicos

Como hemos visto, en los últimos años la biología celular moderna creó sistemas para alterar genéticamente los organismos vivos. La transgénesis se realiza en dos etapas esenciales. En la primera, el ADN foráneo debe ser introducido en la célula. Este proceso puede ser llevado a cabo en eucariotasmediante distintos mecanismos.

Por ejemplo, las células de levaduras tienen capacidad de incorporar ADN del medio cuando la gruesa pared que las rodea es eliminada mediante enzimas específicas que la digieren. En esas condiciones, la inclusión de ciertos iones metálicos favorece la incorporación del ADN externo. Las células de plantas, de animales y de levaduras pueden ser sometidas a un golpe eléctrico muy breve pero de alto voltaje.

Como resultado, la membrana celular se vuelve permisiva al paso de ADN por la aparición de pequeños poros que luego se cierran, permitiendo la sobrevid de la célula. También es posible inyectar ADN dentro de una célula mediante micromanipulación y obtener resultados similares. Un método de introducción de ADN violento pero efectivo es la biobalística. Se utiliza un gas inerte para acelerar partículas microscópicas de oro o tungsteno que han sido previamente recubiertas con ADN. Estas microbalas pasan a través de la pared celular y de las membranas y liberan dentro de la célula el material genético que llevan.

Generalmente, el ADN incorporado por la célula se integra al genoma mediante un mecanismo conocido como "recombinación no homóloga".

Este proceso es muy frecuente en determinadas líneas celulares y el ADN se inserta al azar en una o más regiones del genoma de la célula huésped, haciendo relativamente fácil la obtención de líneas celulares transgénicas. Esta modificación puede realizarse sobre cigotos, que luego son transferidos a una madre portadora que ha sido preparada hormonalmente para recibir el cigoto. En ratones, entre el

10 % y el 30 % de la descendencia obtenida posee el transgén inyectado. Posteriormente, por cruza y selección puede obtenerse una progenie homocigota para el transgén. La obtención de plantas transgénicas puede realizarse imitando a la naturaleza. La bacteria Agrobacterium tumefaciens naturalmente infecta dicotiledóneas a través de heridas, transfiriendo una región de un plásmido que posee, conocido como "Ti". Esta región, que se incorpora al genoma de la célula vegetal, contiene genes que codifican proteínas importantes para la infección. Este sistema natural ha sido modificado de manera de disminuir las alteraciones que produce durante la infección y posibilitar el transporte de genes foráneos. Así, pueden construirse sistemas que integran un gen deseado al genoma de una célula vegetal para obtener en forma simple plantas transgénicas. Los científicos dedujeron que otro camino posible era alterar genes individuales propios del organismo para observar el efecto que esto producía en el vegetal o el animal bajo estudio, para solucionar una enfermedad o para ganar alguna ventaja genética.

Esta metodología, conocida como knockout resulta de sustituir el gen de interés (funcional) por otro similar que ha sido alterado (convirtiéndose en no funcional).

El gen modificado es introducido en células embrionarias. Una vez que el

ADN ha alcanzado el interior de la célula, probablemente la propia maquinaria encargada del mantenimiento del genoma corta y pega el nuevo gen alterado en zonas homólogas del material genético de la célula. Estas células con un alelo alterado son introducidas en embriones tempranos, que darán como resultado animales "quimeras" conteniendo células modificadas y células no modificadas. Mediante cruza puede investigarse si la mutación se ha incorporado a células germinales y también obtener animales con todas sus células modificadas, tanto heterocigotas (un solo alelo alterado) u homocigotas (ambos alelos del gen en estudio alterados). Alterar un gen puede dar como resultado diferentes efectos en el organismo estudiado. En algunos casos, un animal knockout en un determinado gen es incapaz de sobrevivir o de ser gestado correctamente. En otros casos, sólo se detecta la aparición de un fenotipo diferente. También puede ocurrir que la alteración genética introducida no muestre ningún cambio fenotípico aparente.

Bibliografía

Alberts, B., D. Bray, K. Hopkin, et al.: Introducción a la biología celular,

Buenos Aires, Panamericana, 2006.

Curtis, H. y N. Sue Barnes: Biología, Buenos Aires, Panamericana, 2000.

Izquierdo Rojo, Marta: Ingeniería genética y transferencia génica,

Madrid, Pirámide, 2001.

Lodish, H., J. Darnel, A. Berk, et al.: Biología celular y molecular,

Buenos Aires, Panamericana, 2005.

Parekh, S. R. (ed.): The GMO Handbook, Humana Press, Totowa, 2004.

4.2.5  Tecnología de ADN recombinante en la agricultura

El término DNA recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Aunque el proceso genético de la recombinación produce DNA recombinante, este término se reserva a las moléculas de DNA producidas por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas.

La tecnología del DNA recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de bacterias y de virus. La utilización del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias específicas de DNA a partir de una población de secuencias mezcladas. Los procedimientos básicos incluyen una serie de pasos:

1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de restricción, que reconocen y cortan las moléculas de DNA por secuencias nucleotídicas específicas.

2. Los fragmentos producidos mediante la digestión con enzimas de restricción se unen a otras moléculas de DNA que sirven de vectores.

Los vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y facilitan la manipulación de la molécula de DNA recombinante recién creada.

3. La molécula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de DNA insertado, se transfiere a una célula huésped.

Dentro de esta célula, la molécula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas de copias idénticas conocidas como “clones”.

4. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el DNA recombinante, creándose una población de células idénticas, que llevan todas la secuencia clonada.

5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las células huésped, purificarse y analizarse.

6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y el producto génico puede aislarse y examinarse.

Bibliografía

ü http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNArecombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pdf

ü www.cultek.com

4.2.4   Vectores de clonación

Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de DNA puede llegar a entrar en una célula huésped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas características:

1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta.

2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima.

3. Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tiene) para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.

4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar. Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plásmidos, los bacteriófagos y los cósmidos.

  

 Ø  Plásmidos.

Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado o diseñado muchos plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibiótico s específicos. El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos diseñados que se utilizó en DNA recombinante. Este plásmido tiene un origen de replicación (ori+), dos genes de selección (resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de restricción únicos.

Ø  Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13.

Lambda es un bacteriófago muy utilizado en experimentos de DNA recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes de lambda, y se conoce toda la secuencia nucleotídica de su genoma. El tercio central de su cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse por DNA exógeno sin afectar la capacidad del fago para infectar células y formar calvas. Se han desarrollado más de 100 vectores basados en el fago lambda, eliminando diversas porciones del grupo génico central. Para clonar utilizando el fago lambda, se corta el DNA del fago con una enzima de restricción (por ejemplo, EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo, un brazo derecho y una región central. Se aíslan los brazos y se ligan (utilizando la DNA ligasa) a un segmento de DNA obtenido tras cortar DNA genómico con la misma enzima de restricción (en este ejemplo, con EcoRI).

Las moléculas recombinantes resultantes pueden introducirse en células huésped bacterianas por transfección. Primero, se permeabilizan las células huésped mediante un tratamiento químico, y se mezclan con las moléculas ligadas. Los vectores que contienen el inserto entran en las células huésped, donde dirigen la síntesis de fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto de DNA. Como alternativa, se mezcla el DNA de lambda que contiene el inserto con los componentes proteicos del fago; de esta mezcla se forman partículas fágicas infectivas. Los fagos pueden amplificarse haciéndolos crecer en placas sembradas con bacterias, donde se formarán calvas, o bien infectando células en un medio líquido y recogiendo las células lisadas.

Ø  Los cósmidos y los vectores transbordadores

Los cósmidos son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico. Los cósmidos contienen la secuencia “cos” del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmídicas de replicación y de genes de resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los contienen. El DNA de los cósmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas infectivas. Una vez el cósmido entra en la célula huésped, se replica como un plásmido. Puesto que la mayoría del genoma de lambda se ha delecionado, los cósmidos pueden transportar insertos de DNA mucho más grandes que los que lambda puede llevar. Los cósmidos pueden transportar casi 50kb de DNA insertado, mientras que los vectores fágicos pueden acomodar insertos de DNA de unas

15kb y los plásmidos generalmente están limitados a insertos de 5-10kb.

  

El cósmido pJBS contiene un origen de replicación bacteriano (ori), un solo sitio cos, un gen de resistencia a ampicilina (ampR, para seleccionar las colonias que han incorporado el cósmido), y una región que contiene cuatro sitios de restricción para la clonación (BamHI, EcoRI, ClaI y Hindlll). Puesto que el vector es pequeño

(5,4kb de longitud), puede aceptar segmentos de DNA exógeno de 33 a 46kb de longitud. El sitio cos permite que el cósmido que contenga un inserto grande se empaquete con proteínas de cubierta vírica de lambda como si fuesen cromosomas víricos. Las cubiertas víricas que contienen un cósmido pueden utilizarse para infectar células huéspedes adecuados, y el vector, que transporta el inserto de DNA, se transferirá a la célula huésped. Una vez dentro, la secuencia “ori” permite que el cósmido se replique como un plásmido bacteriano.

Existen otros vectores híbridos, construidos con orígenes de replicación provenientes de distintas fuentes (por ejemplo, plásmidos y virus animales como SV40), que pueden replicarse en más de un tipo de célula huésped. Generalmente, estos vectores transbordadores contienen marcadores genéticos que permiten su selección en los dos sistemas huésped, y pueden utilizarse para transportar insertos de

DNA entre E.coli y otras células huésped, como levadura, y viceversa. A menudo, estos vectores se emplean para investigar la expresión génica.

Bibliografía

ü http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNArecombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pdf

4.2.3 Clonación de genes

Clonación de genes, el proceso mediante el cual puede aislarse un gen de entre todos los genes diferentes que existen en un organismo, lo que permite realizar su caracterización. Esto se consigue con la preparación de una batería de bacterias que contienen todos los genes distintos presentes en un organismo de manera que cada una de ellas contiene un solo gen. Esto se lleva a cabo efectuando cortes del ADN de un individuo.

CLONACIÓN
La clonación de fragmento de DNA se efectúa en tres pasos:

CORTE: Las moléculas de DNA se pueden cortar en sitios específicos con endonucleasas de restricción del tipo II. Las endonucleasas de restricción del tipo II reconocen en el DNA de dos bandas secuencias cortas, cortan las dos bandas de la molécula y la mayor parte produce fragmentos de DNA con extremos complementarios de una banda, llamados extremos pegajosos.
La utilidad de las enzimas tipo II para los análisis de DNA se deriva de las siguientes cuatro propiedades importantes:

1.    Reconocen secuencias cortas (de 4 a 7 pares bases), de tal manera que la probabilidad de tener una molécula de DNA por lo menos con un sitio de reconocimiento para cualquier enzima es muy grande.

2.    Cortan siempre los mismos sitios, lo cual hace que las observaciones sean reproducibles y reales.

3.    Cortan virtualmente todos los sitios disponibles en el DNA aunque cortan unos sitios más rápidamente que otros.

4.    La mayoría de las enzimas producen DNA de dos bandas con extremos pegajosos, que son las moléculas más fáciles de ligar In Vitro.

UNION: Dos o más fragmentos unidos pro enzimas forman moléculas recombinantes. Los fragmentos de DNA pueden ser de cualquiera de las siguientes fuentes:

o   DNA naturales de diversos organismos, generados por cualquier sistema de corte.

o   Moléculas de DNA sintetizadas enzimáticamente, usando RNA como molde para la transcriptasa inversa.

o   DNA artificiales producidos por síntesis química y/o enzimática.

CLONACION: Para que la unión de dos moléculas de DNA sea de utilidad práctica, una de las dos debe ser autorreplicante, es decir, debe tener suficiente información para replicarse en alguna célula viva disponible. Plásmidos y Virus llenan esta condición pues pueden ser introducidos a células apropiadas donde se replican normalmente, junto con el DNA inserto. Se debe definir ahora algunos términos útiles:
Vector o Vehículo: Es la molécula autorreplicante.
Inserto: Es el fragmento de DNA "exógeno" que se liga al vector.
Anfitrión: Es la célula empleada en la propagación del vector con su inserto, es decir, el DNA recombinante.
Clonación molecular: Es la propagación en la célula anfitriona de las secuencias de DNA inserto. Las células con un DNA recombinante se pueden clonar.

4.2.2 Enzimas de unión

La DNA ligasa es una enzima que cataliza la formación de puentes fosfodiéster entre los extremos adyacentes 3' OH y 5' fosfato en el DNA. Para la actividad la enzima requiere Mg++ y una unión covalente, derivada del ATP en el caso de la DNA ligasa del bacteriófago T4. La enzima T4 puede unir covalentemente moléculas de DNA con extremos cohesivos compatibles (por ejemplo, unión de hidrógeno del extremo más largo 5' de EcoRI digiriendo fragmentos de DNA) y también fragmentos de DNA con extremos sin punta. El uso en la digestión / restricción del DNA seguido por unión covalente de extremos cohesivos de diferentes fragmentos de DNA forma la base de la enzimología del DNA recombinante.

Bibliografía

ü Http://aportes.educ.ar/biología/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnología-del-adn-recombinante/como_amplificar_el_adn_reaccio.php

4.2.1 Enzimas de corte

A finales de los años 1960, una herramienta molecular útil acudió en ayuda de estos investigadores frustrados, gracias a una serie de estudios realizados por Werner Arber en Suiza y Hamilton Smith en la Universidad Johns Hopkins. Estos investigadores estaban estudiando lo que en principio parecía ser un problema no relacionado. Ellos estaban interesados en saber cómo era posible que algunas bacterias resistiesen a la invasión de los virus. Cuando el ADN viral se introduce en estas bacterias, se corta en pequeños pedazos y se inactiva por medio de unas enzimas denominadas endonucleasas. Smith demostró que una de estas enzimas cortaba el ADN en una secuencia corta de ADN específica. El colega de Smith, Daniel Nathans, reconoció que esto proporcionaba una manera de cortar una molécula de ADN grande en fragmentos más pequeños bien definidos, y utilizó el método para generar el primer mapa físico de un cromosoma, el del virus del mono pequeño SV40. El mapa permitió a Nathans determinar la disposición de los genes individuales dentro del ADN que forma el cromosoma viral. Nathans especuló intuitivamente que los cromosomas más grandes se podrían estudiar de forma similar. Esto anunció la asignación de cromosomas, actividad que establece la base para la asignación del gen de una enfermedad a una región específica de un determinado cromosoma humano.

La enzima del corte de ADN que Smith aisló fue la primera de las más de 1.000 "enzimas de restricción" que se han descubierto en tan solo unas décadas. Las enzimas de restricción no solo permiten la asignación de cromosomas, sino que también permiten a los investigadores generar grandes cantidades de cualquier secuencia de interés específica de ADN. Normalmente estas enzimas no cortan directamente los dos filamentos de ADN, sino que cortan de manera escalonada. Por tanto, sus cortes crean colas cortas de un solo filamento en los extremos de cada fragmento, llamados extremos pegajosos. Los extremos pegajosos se pueden unir a otros filamentos de ADN con la ayuda de otro tipo de enzima, llamada ligasa. En 1973, los investigadores ya estaban usando enzimas de restricción para cortar secuencias específicas de interés del ADN y unirlas al ADN de bacterias. Las bacterias generaban entonces copias del ADN seleccionado con su propio ADN cada vez que se dividían. Como una bacteria simple crece rápidamente, produciendo más de 1.000 millones de copias de sí misma en 15 horas, se pueden producir de esta manera grandes cantidades de una secuencia específica de ADN, en un proceso denominado clonación. El ADN se puede usar para estudios adicionales o para hacer sondas de ADN.

Bibliografía

ü   http://www7.nationalacademies.org/spanishbeyonddiscovery/bio_007548-03.html

4.2 Corte y unión de moléculas de ADN

Los plásmidos son pequeñas moléculas de DNA (de 5.000 pb aproximadamente) que se replican en forma autónoma en células bacterianas.

Son círculos covalentemente cerrados de DNA de doble cadena. La mayoría de los plásmidos contienen genes resistentes a antibióticos, los que permiten el crecimiento de células bacterianas refugiando a los plásmidos bajo condiciones selectivas. Los ejemplos de genes resistentes a antibióticos son los que codifican para la ß lactamasa o neomicina fosfotransferasa, enzimas que inactivan ampicilina o aminoglucósidos respectivamente.

Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico. Debido a su tamaño relativamente pequeño, los plásmidos contienen solo algunos únicos sitios de clivaje de enzimas de restricción. Luego de la digestión de un plásmido en un único sitio de restricción el plásmido circular se vuelve lineal.

Se puede crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este proceso consta de las siguientes etapas:

1. Se corta el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos cohesivos.

2. Se corta el ADN que se quiere multiplicar. Asegurándose que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse.

3. Se une el gen que se desea introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-ligasa y luego se introduce el plásmido inserto en bacterias.

4. Se selecciona las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán. Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva el nombre de clonación.

Bibliografía

ü  Http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos5.htm

ü Http://es.wikipedia.org/wiki/ADN_recombinante