4.2.4   Vectores de clonación

Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de DNA puede llegar a entrar en una célula huésped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas características:

1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta.

2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima.

3. Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tiene) para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.

4. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar. Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plásmidos, los bacteriófagos y los cósmidos.

  

 Ø  Plásmidos.

Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican autónomamente en las células bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado o diseñado muchos plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibiótico s específicos. El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos diseñados que se utilizó en DNA recombinante. Este plásmido tiene un origen de replicación (ori+), dos genes de selección (resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de restricción únicos.

Ø  Bacteriófagos lambda (fago λ) y M13.

Lambda es un bacteriófago muy utilizado en experimentos de DNA recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes de lambda, y se conoce toda la secuencia nucleotídica de su genoma. El tercio central de su cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse por DNA exógeno sin afectar la capacidad del fago para infectar células y formar calvas. Se han desarrollado más de 100 vectores basados en el fago lambda, eliminando diversas porciones del grupo génico central. Para clonar utilizando el fago lambda, se corta el DNA del fago con una enzima de restricción (por ejemplo, EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo, un brazo derecho y una región central. Se aíslan los brazos y se ligan (utilizando la DNA ligasa) a un segmento de DNA obtenido tras cortar DNA genómico con la misma enzima de restricción (en este ejemplo, con EcoRI).

Las moléculas recombinantes resultantes pueden introducirse en células huésped bacterianas por transfección. Primero, se permeabilizan las células huésped mediante un tratamiento químico, y se mezclan con las moléculas ligadas. Los vectores que contienen el inserto entran en las células huésped, donde dirigen la síntesis de fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto de DNA. Como alternativa, se mezcla el DNA de lambda que contiene el inserto con los componentes proteicos del fago; de esta mezcla se forman partículas fágicas infectivas. Los fagos pueden amplificarse haciéndolos crecer en placas sembradas con bacterias, donde se formarán calvas, o bien infectando células en un medio líquido y recogiendo las células lisadas.

Ø  Los cósmidos y los vectores transbordadores

Los cósmidos son vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmídico. Los cósmidos contienen la secuencia “cos” del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmídicas de replicación y de genes de resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los contienen. El DNA de los cósmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas infectivas. Una vez el cósmido entra en la célula huésped, se replica como un plásmido. Puesto que la mayoría del genoma de lambda se ha delecionado, los cósmidos pueden transportar insertos de DNA mucho más grandes que los que lambda puede llevar. Los cósmidos pueden transportar casi 50kb de DNA insertado, mientras que los vectores fágicos pueden acomodar insertos de DNA de unas

15kb y los plásmidos generalmente están limitados a insertos de 5-10kb.

  

El cósmido pJBS contiene un origen de replicación bacteriano (ori), un solo sitio cos, un gen de resistencia a ampicilina (ampR, para seleccionar las colonias que han incorporado el cósmido), y una región que contiene cuatro sitios de restricción para la clonación (BamHI, EcoRI, ClaI y Hindlll). Puesto que el vector es pequeño

(5,4kb de longitud), puede aceptar segmentos de DNA exógeno de 33 a 46kb de longitud. El sitio cos permite que el cósmido que contenga un inserto grande se empaquete con proteínas de cubierta vírica de lambda como si fuesen cromosomas víricos. Las cubiertas víricas que contienen un cósmido pueden utilizarse para infectar células huéspedes adecuados, y el vector, que transporta el inserto de DNA, se transferirá a la célula huésped. Una vez dentro, la secuencia “ori” permite que el cósmido se replique como un plásmido bacteriano.

Existen otros vectores híbridos, construidos con orígenes de replicación provenientes de distintas fuentes (por ejemplo, plásmidos y virus animales como SV40), que pueden replicarse en más de un tipo de célula huésped. Generalmente, estos vectores transbordadores contienen marcadores genéticos que permiten su selección en los dos sistemas huésped, y pueden utilizarse para transportar insertos de

DNA entre E.coli y otras células huésped, como levadura, y viceversa. A menudo, estos vectores se emplean para investigar la expresión génica.

Bibliografía

ü http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/DNArecombinante/Tecnica%20DNA%20recombinante.pdf